“基因編輯”近年來在生物學(xué)領(lǐng)域如雷貫耳，而以CRISPR/Cas為代表的基因編輯系統(tǒng)，正是其中的“當(dāng)紅明星”。就在2020年，CRISPR/Cas領(lǐng)域的開創(chuàng)者埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶和詹妮弗·杜德納，摘得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)桂冠。由于CRISPR/Cas在治療、檢測、育種等應(yīng)用中表現(xiàn)出了非凡潛力，相關(guān)的研究如同雨后春筍般不斷涌現(xiàn)。

　　不過，這個(gè)系統(tǒng)長期以來也有一些難以攻破的“缺陷”，最突出的一個(gè)問題就是傳統(tǒng)的Cas蛋白分子尺寸普遍太大，導(dǎo)致包裝困難，這就限制了它們?cè)诨蛑委煼矫娴氖褂?。所以，開發(fā)更小的編輯工具，成為當(dāng)前這個(gè)領(lǐng)域的重要研究方向之一，也是各國競爭激烈的一塊“高地”。

　　9月2日，上海科技大學(xué)物質(zhì)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院的季泉江課題組，在《自然-化學(xué)生物學(xué)》（Nature Chemical Biology）上報(bào)道了一種全新的基因編輯工具CRISPR-AsCas12f1。這是迄今發(fā)現(xiàn)最小的有編輯活性的Cas蛋白，僅422個(gè)氨基酸，比傳統(tǒng)的Cas9小一半以上。那么這一基因編輯工具有什么特點(diǎn)？與其他已有工具相比有哪些優(yōu)勢(shì)？應(yīng)用前景又如何？對(duì)此，我們請(qǐng)課題組負(fù)責(zé)人季泉江教授來聊聊他的看法。

　　季泉江課題組發(fā)表在《自然-化學(xué)生物學(xué)》的極小CRISPR基因編輯系統(tǒng)論文截圖 | Nature

　　CRISPR系統(tǒng)是如何成為今天的主流基因編輯工具的？

　　季泉江：在CRISPR系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)之前，主要用的是ZFN和TALEN核酸酶系統(tǒng)，它們也能實(shí)現(xiàn)一部分基因編輯的功能，但是具體操作起來十分困難，而且效率效果上都非常不理想。2012年CRISPR技術(shù)出現(xiàn)之后，ZFN和TALEN很快就被淘汰了。CRISPR系統(tǒng)大致相當(dāng)于是細(xì)菌的“免疫系統(tǒng)”，它是用來對(duì)付噬菌體的，包括一串能記錄噬菌體信息的DNA序列、一段能當(dāng)向?qū)У腞NA，以及一把能切割噬菌體DNA的“剪刀”——Cas蛋白。噬菌體會(huì)感染和殺死細(xì)菌，但偶爾有細(xì)菌逃過一劫，就有機(jī)會(huì)通過CRISPR系統(tǒng)把噬菌體的DNA碎片收集起來，做成“檔案”放進(jìn)自己的基因組里。之后如果再有相同的噬菌體來入侵，細(xì)菌就可以派Cas蛋白按圖索驥去剪斷噬菌體的DNA，防止再次“感染”。

　　獲得諾獎(jiǎng)的兩位科學(xué)家，就是揭示了Cas9蛋白具體是如何在RNA引導(dǎo)下去切割DNA的，知道了它的機(jī)制，我們就可以自己制造“新檔案”，讓CRISPR系統(tǒng)去切我們?cè)O(shè)計(jì)的目標(biāo)DNA，實(shí)現(xiàn)基因編輯的功能。后來隨著CRISPR技術(shù)的不斷拓展，又衍生出其他很多應(yīng)用，不僅能切目的基因，還能在細(xì)胞里標(biāo)記特定基因的位置，特異性激活某些基因的轉(zhuǎn)錄，還能在不切斷DNA的情況下修改基因等等。這樣CRISPR就成為目前全世界最流行的基因編輯工具。

　　CRISPR/Cas系統(tǒng)開啟了基因編輯的新紀(jì)元 | Janet Iwasa for the Innovative Genomics Institute at UC Berkeley

　　近年來不斷有更小的Cas蛋白陸續(xù)報(bào)道出來，這類“極小型”的基因編輯工具有什么特殊的意義？

　　季泉江：有了CRISPR基因編輯技術(shù)，就有機(jī)會(huì)用它去治療一些以前沒有辦法治愈的遺傳疾病。但是要治療基因缺陷疾病，不是像平時(shí)吃藥那么簡單把藥吃到胃里，而是得想辦法把基因編輯工具送到細(xì)胞里面，這就需要一個(gè)能通往細(xì)胞內(nèi)部的“運(yùn)輸車”來完成這個(gè)任務(wù)。而目前公認(rèn)最安全有效的“運(yùn)輸車”是一種腺相關(guān)病毒AAV，這種病毒經(jīng)過人工改造，不帶有任何會(huì)致病的基因，也不能自我復(fù)制，并且可以讓它只進(jìn)入一些特定的器官或組織，所以AAV就成為了非常可靠的運(yùn)輸工具。

　　利用病毒實(shí)現(xiàn)向細(xì)胞內(nèi)部“送貨”的功能 | NIH

　　但美中不足的是，AAV的容量很有限，最多只能容納約4700個(gè)堿基對(duì)的DNA序列。目前主流的基因編輯工具，類似Cas9和Cas12a，它們的編輯效率雖然很高，但是這些基因編輯系統(tǒng)分子尺寸都比較大，僅核酸酶的部分就普遍大于1,000個(gè)氨基酸（3000個(gè)堿基對(duì)），如果再加上引導(dǎo)RNA、啟動(dòng)子等其它元件，就已經(jīng)超過了單個(gè)AAV的裝載極限。這就好比我們要搬家，卡車容量是固定的，如果家具體積都很大，一輛車裝不下，就只能多花錢再雇一輛?，F(xiàn)在很多基因編輯器的遞送也采用了這種方法，將編輯器拆成兩份分別裝在兩個(gè)AAV中，讓它們到達(dá)細(xì)胞之后再組裝起來發(fā)揮功能。但如果我們的家具都很小，一輛車就能裝完，不僅裝下Cas蛋白，還能同時(shí)帶上一些其他的功能元件，就能節(jié)約很多成本，同時(shí)提高了效率。這也就是開發(fā)小型編輯工具的意義。最近幾年，關(guān)于小型CRISPR系統(tǒng)的研究報(bào)道也逐漸增加，大多都是Doudna團(tuán)隊(duì)做的工作。

　　近年來小型CRISPR系統(tǒng)的研究大多由詹妮弗·杜德納團(tuán)隊(duì)完成 | American Academy of Achievement

　　您是如何關(guān)注到Cas12f系統(tǒng)的？

　　季泉江：小型CRISPR系統(tǒng)一直是我們研究團(tuán)隊(duì)關(guān)注的重點(diǎn)，之前我們就報(bào)道了一種嗜熱鏈球菌的小型Cas9蛋白（St1Cas9），闡明了它識(shí)別和切割靶向DNA鏈的具體分子機(jī)制，論文去年發(fā)表在《自然·催化》（Nature Catalysis）雜志上。

　　2020年初的新冠疫情期間，我們注意到一個(gè)比較特殊的蛋白，就是Cas12f。這個(gè)酶最早是Doudna課題組在2018年報(bào)道的，當(dāng)時(shí)只發(fā)現(xiàn)它能靶向切割單鏈DNA，而在體內(nèi)的測試中沒有表現(xiàn)出切割雙鏈DNA的活性。不能在體內(nèi)切割雙鏈DNA，意味著無法實(shí)現(xiàn)更多的編輯功能，所以當(dāng)時(shí)推測這個(gè)酶不能成為基因編輯工具。

　　在這之后，立陶宛的一個(gè)課題組又重新鑒定了Doudna發(fā)現(xiàn)的蛋白，同時(shí)還鑒定了一批它的同源蛋白。他們發(fā)現(xiàn)，這類蛋白在體外的生化反應(yīng)中，其實(shí)是可以依賴PAM（注：PAM是Cas蛋白識(shí)別切割位點(diǎn)的特殊DNA序列）去切割雙鏈DNA的，這就極大激發(fā)了我們的研究興趣。所以，我們當(dāng)時(shí)就想進(jìn)一步探索一下它到底是否具有基因編輯活性。由于我們課題組之前在細(xì)菌基因編輯方面的積累了不少經(jīng)驗(yàn)，就迅速做了一些測試，結(jié)果意外地發(fā)現(xiàn)，這個(gè)蛋白家族中的AsCas12f1在細(xì)菌里的基因編輯效率很高，和Cas9差不多，于是我們開始著手系統(tǒng)地研究這個(gè)蛋白。

　　季泉江教授 | 張雅拍攝

　　AsCas12f1有哪些核心特征？

　　季泉江：AsCas12f1來自于一種嗜熱細(xì)菌（Acidibacillus sulfuroxidans）。這種細(xì)菌最早是在美國黃石國家公園的熱泉里發(fā)現(xiàn)的。

　　AsCas12f1有幾個(gè)非常獨(dú)特的地方。首先它識(shí)別核酸的方式很特殊，之前的Cas9、Cas12a等都是依靠單個(gè)Cas蛋白來識(shí)別DNA和引導(dǎo)RNA的。而AsCas12f1則是通過兩個(gè)相同的蛋白形成不對(duì)稱的二聚體來識(shí)別DNA和引導(dǎo)RNA的，這2個(gè)蛋白的氨基酸序列是完全相同的，但它們各自空間結(jié)構(gòu)卻不同，通過“二合一”拼成一個(gè)新的蛋白復(fù)合體。這樣的分子機(jī)制是非常罕見和新穎的，我們?cè)诳吹剿耐吹鞍捉Y(jié)構(gòu)之后，都不由感嘆大自然的鬼斧神工，從某種意義上來說，這也解釋了為什么編碼這個(gè)蛋白所需堿基數(shù)比Cas9少一半以上。

　　Cas9是一個(gè)完整的“大”蛋白，而Cas12f是兩個(gè)同源“小”蛋白組合成的蛋白復(fù)合體，后者所需堿基數(shù)不到前者的一半 | 莜柒繪制

　　其次，AsCas12f1切割DNA的機(jī)制也與以往的Cas蛋白差異很大。以往發(fā)現(xiàn)的Cas蛋白通常是在DNA靶向序列的內(nèi)部（是指Cas蛋白要識(shí)別的那段DNA序列）進(jìn)行切割2次，切斷DNA的2條鏈，留下的切口通常是整齊的平末端或者僅有幾個(gè)堿基的黏性末端。而AsCas12f1的核心切割位點(diǎn)在靶序列之外，分別在靶向鏈（指與引導(dǎo)RNA結(jié)合的那條DNA鏈）上切1次，在非靶向鏈上切2次，一共切3次。這樣就形成了一組不對(duì)稱的切口，在靶向鏈上留下一段較長的DNA“尾巴”。這種不對(duì)稱的雙鏈切割模式目前是比較罕見的，其它Cas蛋白也有在靶序列外剪切的，但切口通常都是對(duì)稱的。我們認(rèn)為這種不對(duì)稱切割的特征，可用來連接一些經(jīng)過設(shè)計(jì)的特殊序列。

　　AsCas12f1切割DNA的機(jī)制 | 莜柒繪制

　　另外，由于這種的蛋白來自于嗜熱細(xì)菌，所以它非常耐熱，最適反應(yīng)溫度在45℃到60℃。蛋白性狀穩(wěn)定，不容易降解，這對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)和一些體外應(yīng)用都非常有利。

　　AsCas12f1系統(tǒng)目前的編輯效果如何？如何解決脫靶等問題？

　　季泉江：我們剛開始是在細(xì)菌上進(jìn)行測試的，主要測試了大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌。它在細(xì)菌上的編輯效率與Cas9是不相上下的，最高可以達(dá)到100%。我們也在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上做了初步的測試，測試的位點(diǎn)里面最高大概在30%左右，目前效率還趕不上Cas9、Cas12a這些常用的Cas蛋白。我們也做過這個(gè)蛋白脫靶相關(guān)的測試，發(fā)現(xiàn)確實(shí)有脫靶現(xiàn)象的存在。針對(duì)效率和脫靶的問題，我們準(zhǔn)備通過分子進(jìn)化的方法進(jìn)行改進(jìn)，這也是目前比較常用的一種方法。

　　利用分子進(jìn)化可以對(duì)CRISPR系統(tǒng)加以改進(jìn) | Pixabay

　　做分子進(jìn)化可以基于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，或者利用隨機(jī)突變找到功能更好的蛋白，這兩種方法我們課題組也都在用。比如我們的蛋白結(jié)合核酸的能力相比Cas9較弱，那就可以把跟核酸結(jié)合區(qū)域的氨基酸突變成帶正電的氨基酸，這樣就能與帶負(fù)電的核酸有更強(qiáng)的結(jié)合力；再比如可以通過引入一些額外的相互作用，改變它對(duì)PAM的識(shí)別，拓展識(shí)別范圍。而脫靶主要是由于Cas蛋白有時(shí)會(huì)切割一些與引導(dǎo)RNA匹配不完美的其他序列，我們就可以通過理性設(shè)計(jì)優(yōu)化Cas蛋白和核酸的互作，減少蛋白對(duì)不完美匹配的容忍度，來降低脫靶的幾率。

　　這項(xiàng)成果有哪些應(yīng)用前景？

　　季泉江：不論是AsCas12f1蛋白自身，還是用它改造出的一些衍生基因編輯工具，我覺得都可以應(yīng)用在疾病治療方面，比如說遺傳性疾病、感染性疾病的治療。另一個(gè)就是可以利用Cas12家族蛋白的附加切割活性，將它改造成核酸檢測的工具，這種檢測工具的精度能夠分辨出1個(gè)堿基的差異，通常半小時(shí)就可以看到檢測結(jié)果，后期可能提高到更快，在對(duì)新冠病毒這樣的病原體進(jìn)行快速檢測和分型上很有前景。

　　AsCas12f1系統(tǒng)對(duì)病原體的快速檢測和分型很有前景 | Pixabay

　　在進(jìn)行這項(xiàng)研究的過程中遇到了哪些困難？

　　季泉江：總體來說我們?cè)趯?shí)驗(yàn)的部分還是進(jìn)展比較順利的，但是投稿過程中確實(shí)遇到了比較郁悶的階段。我們最先投稿到《科學(xué)》，《科學(xué)》的編輯還是比較欣賞這個(gè)工作的，但最終還是被雜志的顧問委員會(huì)拒掉了。之后我們轉(zhuǎn)投到了《自然·生物技術(shù)》，《自然·生物技術(shù)》的編輯也很認(rèn)可，并很快送審了我們的文章。一審我們得到了三份相對(duì)來說中立且積極的審稿意見，經(jīng)過了幾個(gè)月補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)后再次送審。二審時(shí)有兩位審稿人已經(jīng)同意文章發(fā)表，但有一位審稿人卻變得比較消極和反對(duì)，最終編輯還是拒掉了我們的稿件。接下來我們將文章轉(zhuǎn)至《自然》系列的另一個(gè)雜志《自然·化學(xué)生物學(xué)》，《自然·化學(xué)生物學(xué)》的編輯根據(jù)之前的審稿意見，沒有再次送審，直接接收了我們的文章。

　　您認(rèn)為要獲得此類創(chuàng)新度比較高的科研成果，有哪些因素至關(guān)重要？

　　季泉江：我覺得實(shí)驗(yàn)室前期的基礎(chǔ)積累是非常關(guān)鍵的，因?yàn)橐鲈瓌?chuàng)的基因編輯系統(tǒng)開發(fā)，就要求有很全面的綜合能力，其中包括對(duì)微生物學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物信息學(xué)等領(lǐng)域的知識(shí)儲(chǔ)備和技術(shù)積累；對(duì)于這些系統(tǒng)無論在分子層面也還是細(xì)胞層面，都要有非常深入的理解，這樣整體工作推動(dòng)起來會(huì)比較順利，如果存在任何某一方面的短板，都可能遇到難以突破的阻礙；另一方面也需要一個(gè)良好的實(shí)驗(yàn)室氛圍，我們團(tuán)隊(duì)成員相處比較融洽，并且已經(jīng)建立起了知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的傳承體系，讓學(xué)生在研習(xí)期間能盡快學(xué)到必要的核心技術(shù)。

　　季泉江老師指導(dǎo)學(xué)生挑選蛋白質(zhì)晶體 | 季泉江課題組提供

　　基因編輯相關(guān)熱點(diǎn)研究競爭激烈，您未來有哪些研究計(jì)劃，可能面臨的挑戰(zhàn)是什么？

　　季泉江：競爭確實(shí)是一直有的，比如最早立陶宛的研究團(tuán)隊(duì)與Doudna團(tuán)隊(duì)幾乎同時(shí)投稿了關(guān)于Cas9的關(guān)鍵研究，但因?yàn)榱⑻胀饒F(tuán)隊(duì)的投稿過程非常不順利，幾經(jīng)輾轉(zhuǎn)，論文發(fā)表時(shí)已落后于Doudna，最終無緣諾獎(jiǎng)。再比如今年年初，東京大學(xué)的團(tuán)隊(duì)在《分子·細(xì)胞》上首先報(bào)道了與我們的AsCas12f1同源的Un1Cas12f1的結(jié)構(gòu)，而就在第二天，普渡大學(xué)的另一團(tuán)隊(duì)將自己做的相似的工作上傳到了BioRxiv（預(yù)印本平臺(tái)，供作者先行上傳未經(jīng)同行評(píng)議的論文）。前一段時(shí)間兩個(gè)團(tuán)隊(duì)幾乎同時(shí)在BioRxiv上傳了Cas12k蛋白結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究論文，沒過幾天，第3個(gè)團(tuán)隊(duì)的相關(guān)論文就在《科學(xué)》見刊了。

　　我們未來還將繼續(xù)挖掘和開發(fā)更多小型基因編輯系統(tǒng)，開發(fā)衍生的基因編輯相關(guān)應(yīng)用，也會(huì)嘗試一些遺傳疾病和感染疾病治療方面的一些應(yīng)用。但要進(jìn)一步推進(jìn)我們研究的深度和廣度，還需要有更多不同學(xué)科背景的研究者加入我們的研究團(tuán)隊(duì)，或者與我們一起合作來推進(jìn)研究，這樣才能在今天這種激烈的國際競爭中不落人后。

　　季泉江課題組團(tuán)隊(duì)成員 | 季泉江課題組提供

　　論文鏈接：

　　https://www.nature.com/articles/s41589-021-00868-6