未明原因的pFSGS

近來(lái)研究顯示，抗-Nephrin自身抗體（Anti-nephrin Ab）在微小病變（MCD）和局灶性節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）的發(fā)生中扮演重要的作用，本文概述了抗-Nephrin抗體作為MCD和原發(fā)性FSGS（pFSGS）的血液循環(huán)滲透因子的研究進(jìn)展，并對(duì)將來(lái)的研究方向提出了展望。

MCD和FSGS病因主要分三類(lèi)：足細(xì)胞相關(guān)基因遺傳突變引起、感染或藥物使用等繼發(fā)性因素和不明原因的原發(fā)性因素造成。遺傳突變只占比在8~14%左右[1-3]，繼發(fā)性因素占比20-30%[4-5]，剩下的基本都是由不明原發(fā)性因素引起。

循環(huán)因子理論與FSGS

當(dāng)1972年Hoyer等[6]第一次報(bào)道了腎移植術(shù)后復(fù)發(fā)FSGS的患者開(kāi)始，研究人員就推測(cè)血液中某種循環(huán)滲透因子可能引起了FSGS的產(chǎn)生。隨之流行病學(xué)研究顯示，移植后FSGS具有較高的復(fù)發(fā)率，有時(shí)在移植后幾小時(shí)內(nèi)就會(huì)發(fā)生，這結(jié)果進(jìn)一步促使研究人員相信，致病因子可能不是“腎臟內(nèi)的局部現(xiàn)象”，而是一種血液循環(huán)滲透因子，它通過(guò)改變腎小球屏障來(lái)?yè)p傷足細(xì)胞[7-8]。直到2012年Gallon等[9]在一個(gè)FSGS復(fù)發(fā)的患者案例研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)移植腎被切除并再次移植給另一個(gè)沒(méi)有FSGS病史的受者時(shí)，腎臟的功能得到了恢復(fù)，且FSGS特有的組織病理學(xué)損害也發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，這基本確定了是血液中存在的某些循環(huán)滲透因子導(dǎo)致了FSGS的發(fā)生。

隨后幾年，大量的研究資源投入到尋找在MCD和pFSGS蛋白尿形成中起關(guān)鍵作用的循環(huán)滲透因子[10-11]。盡管投入了非常大的資源和研究努力，這些未知的循環(huán)通透性因子的鑒定一直是艱苦漫長(zhǎng)的，研究者并沒(méi)有找到可靠一致的生物標(biāo)志物。

一些被認(rèn)為增加血清蛋白血管透過(guò)性的候選生物標(biāo)志物分子（表1），包括可溶性尿激酶型纖溶酶原激活物受體(suPAR)[12]、心肌營(yíng)養(yǎng)素樣細(xì)胞因子-1 (CLCF-1)[13]、可溶性CD40配體[14]等等，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與MCD和pFSGS的進(jìn)展和復(fù)發(fā)相關(guān)，但是驗(yàn)證其臨床效用的研究表明，這些標(biāo)記物并不在MCD和FSGS的發(fā)展中起到?jīng)Q定性作用，它們也可以在健康人和非腎病綜合征患者血清中檢測(cè)到[15-17]。

表1. FSGS和MCD相關(guān)循環(huán)滲透因子及其局限性

Nephrin蛋白介紹

1966年，在一組患有先天性腎病綜合征（NPHS1)[39]的芬蘭家系中，研究發(fā)現(xiàn)這是一種罕見(jiàn)的遺傳基因突變?cè)斐傻哪I臟疾病，但導(dǎo)致這種疾病的具體基因未知。直到1998年NPHS1基因所在的關(guān)鍵染色體區(qū)域被鑒定和測(cè)序， NPHS1基因的表達(dá)產(chǎn)物被命名為Nephrin，其基因座定位于染色體19q12-q13.1[40-41]。雖然Nephrin蛋白的精確結(jié)構(gòu)和功能在此時(shí)仍然未知，但據(jù)推測(cè)，其結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)類(lèi)似于屬于免疫球蛋白家族的一大類(lèi)細(xì)胞粘附受體，它可以作為粘附受體和信號(hào)蛋白[40]發(fā)揮作用。在后續(xù)研究中[42-43]，證實(shí)Nephrin是形成足細(xì)胞裂孔隔膜相關(guān)復(fù)合物（slit diaphragm, SD）的組成部分，其與腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜（GBM）一起形成腎小球?yàn)V過(guò)屏障。（圖1）

圖1. Nephrin抗體誘導(dǎo)縱膈改變、足細(xì)胞損傷和蛋白質(zhì)滲漏入尿液中

Nephrin是一種跨膜蛋白，其N(xiāo)-末端為胞外片段，C-末端為胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，使用對(duì)人Nephrin的N-末端特異的抗體檢測(cè)證實(shí)了其位于腎的縱膈[44]。整個(gè)蛋白由八個(gè)免疫球蛋白樣胞外結(jié)構(gòu)域、一個(gè)纖連蛋白III型樣結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)短的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成，它通過(guò)與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架[40,45]的相互作用而維持足細(xì)胞的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能。作為免疫球蛋白超家族的細(xì)胞表面受體蛋白，Nephrin還參與細(xì)胞間粘附和信號(hào)傳導(dǎo)功能。當(dāng)Src激酶家族的Fyn磷酸化Nephrin的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的六個(gè)酪氨酸殘基(Tyr1114、Tyr1136、Tyr1176、Tyr1183、Tyr1193、Tyr1217)中的一個(gè)或多個(gè)時(shí)，由Nephrin的胞內(nèi)尾部介導(dǎo)的下游信號(hào)傳導(dǎo)被激活[46]。具體表現(xiàn)為磷酸化的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域會(huì)與幾種足細(xì)胞胞質(zhì)蛋白相互作用，包括podocin、CD2AP、NEPH1和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，以將下游信號(hào)傳遞到肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，從而調(diào)節(jié)足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性和腎小球?yàn)V過(guò)狹縫的功能[47-48]。磷酸化Nephrin促進(jìn)Nck銜接蛋白、ZO-1、連環(huán)蛋白、桶蛋白、足細(xì)胞素、CD2-AP和PI3K等的募集并與之相互作用，Nck銜接蛋白發(fā)出肌動(dòng)蛋白重塑的信號(hào)，并參與多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，從而影響對(duì)足細(xì)胞穩(wěn)定至關(guān)重要的肌動(dòng)蛋白的聚合動(dòng)力學(xué)[48-49]（圖2）。

圖2. 相鄰足突之間的縫隙層示意圖。

腎病綜合征與Nephrin抗體

在對(duì)NPHS1基因（Nephrin）進(jìn)行鑒定和測(cè)序進(jìn)行研究之前，科學(xué)家已經(jīng)開(kāi)始對(duì)能夠結(jié)合到腎小球足突表面的抗體及其誘導(dǎo)蛋白尿的特征進(jìn)行了探索。Orikasa等人[50]用膠原蛋白酶處理過(guò)的Wistar大鼠腎小球免疫BALB/b小鼠，產(chǎn)生了高度器官特異性和物種特異性的抗體IgG1，稱(chēng)為mAb 5-1-6。在體外研究中，觀察到mAb 5-1-6結(jié)合到腎小球足突的表面。當(dāng)在大鼠中注射該mAb時(shí)，立即誘導(dǎo)蛋白尿，不需要補(bǔ)體激活。**這項(xiàng)開(kāi)拓性的研究是建立循環(huán)滲透因子抗體和腎病綜合征蛋白尿誘導(dǎo)之間強(qiáng)關(guān)聯(lián)的證據(jù)。**該方法后來(lái)被研究人員用于在動(dòng)物模型中產(chǎn)生類(lèi)似的Nephrin抗體，以研究腎小球內(nèi)的Nephrin定位，并作為誘導(dǎo)蛋白尿和腎病狀況的潛在藥物靶點(diǎn)[42-43,51]。

雖然動(dòng)物模型已經(jīng)成功地證明了抗-Nephrin抗體在介導(dǎo)足細(xì)胞損傷中的作用，但在過(guò)去幾年中，研究其在腎病綜合征患者中的作用的報(bào)道仍然很少。Watts等人[37]最近進(jìn)行的一項(xiàng)多中心隊(duì)列研究，重新激發(fā)了人們對(duì)重新評(píng)估抗-Nephrin抗體和腎病綜合征發(fā)展之間關(guān)系的興趣。在研究招募的MCD患者中，18例（29%）抗-Nephrin抗體檢測(cè)陽(yáng)性，44例（71%）檢測(cè)陰性?；顧z分析顯示Nephrin所在的足細(xì)胞SD區(qū)域與點(diǎn)狀的IgG沉積共定位。在一些IgG沉積的活組織檢查中，出現(xiàn)一種Nephrin的重新分布遠(yuǎn)離SD的現(xiàn)象，表明抗體對(duì)Nephrin定位和破壞的影響。當(dāng)MCD活動(dòng)期患者接受治療時(shí)，高水平的循環(huán)抗-Nephrin抗體顯著減少或消失，這與治療期顯著的蛋白尿減少相關(guān)。Hengel等人[36]最近的一項(xiàng)研究顯示，在539名被診斷為腎小球疾病的患者中，105名成人MCD患者中有46名（44%），74名FSGS患者中有7名（9%）都具有較高的抗-Nephrin抗體水平。此外，在被診斷為特發(fā)性腎病綜合征的兒童隊(duì)列中，182名中有94名（占52%）表現(xiàn)出較高水平的抗-Nephrin抗體。**在未接受免疫抑制治療的患者中發(fā)現(xiàn)MCD和特發(fā)性腎病綜合征患者的抗體陽(yáng)性率更是高達(dá)69%和90%。**在研究受試者中，與抗體檢測(cè)陰性的患者相比，陽(yáng)性的MCD和FSGS患者表現(xiàn)出更嚴(yán)重的腎病綜合征。在小鼠模型中，觀察到IgG沉積在足細(xì)胞的SD區(qū)，特別是在出現(xiàn)足突融合區(qū)域沉積更明顯。Shirai等人[38]同樣報(bào)道了這一觀察結(jié)果。在隨訪期間，觀察到接受糖皮質(zhì)激素和環(huán)孢素免疫抑制治療的患者表現(xiàn)出短暫的緩解，而接受利妥昔單抗（CD20）治療的患者表現(xiàn)出抗體水平完全和持續(xù)的緩解[52]。為了檢測(cè)抗-Nephrin抗體對(duì)縱裂膈膜的直接作用，對(duì)注射抗體的小鼠在3周時(shí)的磷酸化蛋白質(zhì)組分析顯示Nephrin在酪氨酸殘基Y1191處磷酸化增加。這個(gè)酪氨酸殘基的磷酸化可能導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白裝配、細(xì)胞骨架重組和Nephrin內(nèi)吞。

在Cui和Zhao[53]關(guān)于Hengel等人[36]研究的綜述報(bào)告中，提出這些抗-Nephrin自身抗體可能不僅限于IgG類(lèi)，在MCD和FSGS中也可觀察到其他類(lèi)如IgM的沉積。盡管Shirai等人[38]在復(fù)發(fā)期間的一些活組織檢查中觀察到痕量IgM和C3的沉積，但這表明這些沉積并沒(méi)有與Nephrin共定位。此外，在緩解后沒(méi)有觀察到IgG沉積的跡象，這表明循環(huán)抗-Nephrin抗體高度可能是一種循環(huán)通透性因子，與腎移植后復(fù)發(fā)的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。在Bressendorff等人[52]最近報(bào)告的一個(gè)病例中，一名84歲的男性患者因呼吸急促和水腫入院，他有多種疾病史，包括3期慢性腎病，經(jīng)治療后出院?；颊咴俅稳朐簳r(shí)，經(jīng)尿檢發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)進(jìn)行性急性腎損傷，伴有低白蛋白血癥和蛋白尿。腎活檢顯示FSGS發(fā)展為與Nephrin重疊的點(diǎn)狀I(lǐng)gG沉積，伴有足突消失，但未觀察到IgM、IgA、C3、C1q或κ和λ輕鏈的形成，患者對(duì)糖皮質(zhì)激素治療無(wú)反應(yīng)。檢測(cè)顯示循環(huán)抗-Nephrin抗體陽(yáng)性，該抗體在血漿置換治療后逐漸下降。經(jīng)過(guò)七次血漿置換治療后，抗體水平低于檢測(cè)限，與對(duì)照人群中報(bào)告的水平相似，同時(shí)基線腎功能恢復(fù)，腎功能保持穩(wěn)定一年半，無(wú)復(fù)發(fā)跡象。

腎移植FSGS復(fù)發(fā)與Nephrin抗體

在Shirai等人[38]進(jìn)行的一項(xiàng)多中心研究中，在22例FSGS腎移植受者（8例為基因突變致病和14例為非遺傳性患者）中，14例非遺傳性FSGS患者中有11例移植后出現(xiàn)FSGS復(fù)發(fā)，與非復(fù)發(fā)FSGS（165 U/mL）和遺傳性FSGS（113 U/mL）患者相比，11例復(fù)發(fā)患者的抗-Nephrin抗體水平顯著升高（移植前和移植后復(fù)發(fā)時(shí)分別為831U/mL和1292 U/mL)。抗體水平的升高與提示出現(xiàn)了FSGS的復(fù)發(fā)，抗-Nephrin抗體水平也與移植后患者的蛋白尿水平相關(guān)，在復(fù)發(fā)性FSGS患者中觀察到更高水平的蛋白尿。最近Batal I等[54]評(píng)估了腎移植術(shù)前的抗-Nephrin抗體水平對(duì)術(shù)后彌漫性足細(xì)胞?。―P）復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值，回顧性分析了38例移植前留存有血清樣本的患者，在中位隨訪43個(gè)月（四分位距8-79個(gè)月）后，21例患者出現(xiàn)DP復(fù)發(fā)，17例無(wú)DP復(fù)發(fā)。移植前抗-Nephrin抗體水平能夠預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)（曲線下面積0.78，P=0.03）。當(dāng)用之前研究的187U/ml作為閾值診斷時(shí)，21例復(fù)發(fā)患者中有8例（38%）為抗體陽(yáng)性，17例無(wú)復(fù)發(fā)患者中全部為抗體陰性（P=0.005）?？?Nephrin抗體水平預(yù)測(cè)DP具有100%的特異性、100%的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、38%的敏感性和57%的陰性預(yù)測(cè)值。**提示術(shù)前高水平的抗-Nephrin抗體患者，術(shù)后要密切關(guān)注腎病的復(fù)發(fā)（本隊(duì)列顯示100%復(fù)發(fā)），需程序性監(jiān)測(cè)抗-Nephrin抗體水平。**生存分析（time-to-event analysis）結(jié)果顯示，移植前抗-Nephrin抗體陽(yáng)性的患者DP復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更高（風(fēng)險(xiǎn)比4.9，95%置信區(qū)間1.25-18.8，P<0.001）。

展望：機(jī)遇和挑戰(zhàn)

與其他血液循環(huán)滲透因子（suPAR、CD40等）不同，目前還沒(méi)有研究否定抗-Nephrin抗體作為FSGS和MCD的潛在標(biāo)志物和血液循環(huán)滲透因子的臨床價(jià)值。但是已報(bào)道的研究有一定的局限性，未來(lái)可能需要考慮和解決。

（1）超靈敏、標(biāo)準(zhǔn)化定量分析方法對(duì)于確?？?Nephrin抗體檢測(cè)準(zhǔn)確和可比性非常重要。目前主要限制因素是缺乏商業(yè)化的人抗-Nephrin抗體，且抗體是多克隆還是單克隆未知，不同患者間是否一致也未知。因此，目前依賴(lài)于用陽(yáng)性的患者血清來(lái)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，這會(huì)導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)室的閾值不一致。例如，在Watts等人[37]的研究中，對(duì)于1:100的樣品稀釋度，健康人的最大抗-Nephrin抗體閾值設(shè)定為187 U/mL。在Shirai等人[38]的研究中，在1:400的樣本稀釋度下，抗-Nephrin抗體陽(yáng)性閾值被定義為最大抗體滴度(231 U/mL)。另外，抗-Nephrin抗體在血清中含量低，普通的ELISA很難準(zhǔn)確檢測(cè)到如此低豐度的抗體，特別在使用無(wú)抗原包被作為陰性對(duì)照時(shí)，檢測(cè)結(jié)果（OD差值）為陰性的概率大，在Hengel等人[36]在新英格蘭雜志的研究中，通過(guò)使用對(duì)IgG抗體的富集來(lái)提高抗-Nephrin抗體在檢測(cè)樣品中的豐度。基于“富集路徑”的抗-Nephrin抗體檢測(cè)方法研發(fā)，是未來(lái)高靈敏檢測(cè)的一個(gè)發(fā)展方向。

（2）是否有其它循環(huán)滲透因子參與pFSGS？已有研究顯示，并非所有被診斷患有pFSGS或MCD的患者的抗-Nephrin抗體檢測(cè)都呈陽(yáng)性。在Watts[37]研究中，在62名MCD患者中，只有18名抗-Nephrin抗體陽(yáng)性。這一結(jié)果提示，可能有其他循環(huán)滲透因子參與了剩余44例患者的MCD誘發(fā)。在Hengel等人[36]的研究中，觀察到94例特發(fā)性腎病綜合癥患兒為Nephrin抗體陽(yáng)性，而88例為陰性。在成人MCD患者中有46例抗-Nephrin抗體陽(yáng)性和59例抗體陰性，pFSGS患者中有7例抗體陽(yáng)性和67例抗體陰性。這些觀察表明，盡管抗-Nephrin抗體可被視為特發(fā)性腎病綜合征因素包括MCD和FSGS的新的生物標(biāo)志物和循環(huán)滲透因子，它可能并不是對(duì)所有MCD和FSGS患者具有普遍適用性。例如，最近的研究報(bào)道，Crb2是一種重要的縱裂膈肌蛋白，敲除足細(xì)胞CRB2的小鼠在出生后2個(gè)月或出生后立即出現(xiàn)大量蛋白尿，此外還表現(xiàn)出NPHS1&2、PODXL表達(dá)減少以及腎小球WT-1細(xì)胞減少[55-56]。此外，觀察到給予足細(xì)胞CRB2蛋白的小鼠產(chǎn)生針對(duì)足細(xì)胞蛋白的抗CRB2抗體，伴有蛋白尿和MCD和FSGS[57]的特征性特征。然而，關(guān)于在患有特發(fā)性腎病綜合征的人中檢測(cè)CRB2抗體的報(bào)道仍然有限。

（3）抗-Nephrin抗體陽(yáng)性受者腎移植的脫敏治療。脫敏治療方案對(duì)抗-Nephrin抗體陽(yáng)性的受者，術(shù)后FSGS復(fù)發(fā)研究還比較缺乏，目前FSGS復(fù)發(fā)的研究隊(duì)列未區(qū)分出抗體陽(yáng)性這一亞隊(duì)列。早期在Gallon等人[9]的報(bào)告中，10例高風(fēng)險(xiǎn)腎移植受者接受了兩次術(shù)前血漿置換和5次術(shù)后血漿置換，7例患者在終點(diǎn)未發(fā)生FSGS復(fù)發(fā)。在Bressendorff等人[52]最近的一項(xiàng)研究中，一名接受7輪血漿置換治療的患者痊愈，無(wú)復(fù)發(fā)跡象，沒(méi)有復(fù)發(fā)被認(rèn)為是聯(lián)合高劑量糖皮質(zhì)激素治療的結(jié)果。Carvajal Abreu,K.等人[58]還指出，在14周內(nèi)進(jìn)行25次血漿置換，同時(shí)使用甲強(qiáng)龍和潑尼松龍，對(duì)于預(yù)防移植排斥和FSGS復(fù)發(fā)至關(guān)重要。Kim等人[59]的一項(xiàng)研究還顯示，一名腎移植患者在對(duì)鈣調(diào)磷酸酶抑制劑無(wú)反應(yīng)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)，對(duì)其進(jìn)行了13個(gè)療程的血漿置換治療，同時(shí)給予利妥昔單抗，患者獲得了部分恢復(fù)。也有研究顯示，在66例pFSGS受者的研究中，37例接受血漿置換聯(lián)合或不聯(lián)合抗CD20單抗的受者，有62%有FSGS復(fù)發(fā)，27未接受任何脫敏治療的受者中僅有51%復(fù)發(fā)[60]。這些研究表明，預(yù)脫敏方案可降低FSGS的復(fù)發(fā)，但目前暫未有大型研究證實(shí)，對(duì)術(shù)前脫敏治療是否能夠影響FSGS的復(fù)發(fā)，還存在不一致的結(jié)果。未來(lái)研究脫敏治療對(duì)抗-Nephrin抗體陽(yáng)性FSGS這一亞隊(duì)列的脫敏方案顯得比較重要。

（4）最后，目前還沒(méi)有研究檢測(cè)Nephrin不同表位和抗-Nephrin抗體的相互作用，是否有多個(gè)表位表現(xiàn)出抗體結(jié)合能力，及不同表位的結(jié)合能力是否一致等問(wèn)題并不清楚。對(duì)抗-Nephrin抗體結(jié)合Nephrin的特定區(qū)域以誘導(dǎo)Nephrin重新分布和足細(xì)胞損傷也不是很清楚。也沒(méi)有研究確定阻斷Nephrin表位如何能防止與抗體的相互作用。解決這些問(wèn)題對(duì)于闡明Nephrin抗體致病機(jī)制、對(duì)開(kāi)發(fā)針對(duì)抗-Nephrin抗體陽(yáng)性FSGS患者的特異性藥物非常重要。下一步需要對(duì)Nephrin不同結(jié)構(gòu)域、可作為抗-Nephrin抗體結(jié)合位點(diǎn)的各種表位以及可阻斷這些表位以抑制與抗-Nephrin抗體結(jié)合的潛在配體進(jìn)行全面研究。

（本文轉(zhuǎn)自奧根診斷官網(wǎng)）

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