編者按：eDNA分析是一種強(qiáng)大的工具，用于量化和評(píng)估環(huán)境中生物體的多樣性。但是往往，由于水樣采集、運(yùn)輸過(guò)程中的樣品保存和現(xiàn)場(chǎng)過(guò)濾等困難，從水生環(huán)境中分離eDNA是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。這些過(guò)程不僅昂貴且耗時(shí)，還可能導(dǎo)致eDNA降解。2024年11月23日，《環(huán)境DNA》期刊發(fā)表了一項(xiàng)由瑞典?rebro大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)完成的研究，作者包括Viresh Thamke、Yared H. Bezabhe、Jana Jass和Per-Erik Olsson。該團(tuán)隊(duì)提出了一種利用陽(yáng)離子表面活性劑保存水體環(huán)境DNA（eDNA）的新方法，為提升水生生態(tài)系統(tǒng)的物種監(jiān)測(cè)效率提供了突破。為助力全球環(huán)境治理、并供我國(guó)學(xué)者了解最新研究動(dòng)態(tài)信息，編譯分享信息如下，供感興趣的讀者們參閱。因篇幅所限有所簡(jiǎn)略，譯文僅供參考。（按/王芊佳）

為了解決這些難題，一種新的方法是通過(guò)在采集的水中保存eDNA。該研究評(píng)估了三種不同陽(yáng)離子表面活性劑對(duì)斑馬魚(yú)（Danio rerio）線粒體DNA（mtDNA）在微觀世界水中的半衰期的短期和長(zhǎng)期水儲(chǔ)存的影響。所使用的表面活性劑為苯扎氯銨（BAC）、氯化十六烷基吡啶（CPC）和溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）。

研究結(jié)果表明，CPC和CTAB處理可將mtDNA的半衰期延長(zhǎng)3-5倍。通過(guò)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）分析，與未處理的水相比，CPC、CTAB和BAC在30天后的mtDNA保留率分別為17.6%、26.3%和2.2%，而未處理的水僅為0.1%。陽(yáng)離子表面活性劑對(duì)mtDNA的保存作用歸因于其殺菌和細(xì)胞毒性特性，以及它們與DNA分子之間的靜電相互作用，如通過(guò)熒光光譜分析和后續(xù)沉淀所觀察到的。這項(xiàng)的研究結(jié)果確認(rèn)，這是一種廉價(jià)且方便的方法來(lái)保護(hù)水中的eDNA并改善其提取。

卡塔爾的淺水珊瑚調(diào)查。上面是深度約5-8米的珊瑚礁。攝影：王敏幹（John MK Wong） | 綠會(huì)融媒·“海洋與濕地” （圖文無(wú)關(guān)）
研究介紹
我們知道，環(huán)境DNA（eDNA）分析是一種快速、高效的生態(tài)監(jiān)測(cè)技術(shù)，可以精準(zhǔn)探測(cè)和描述生態(tài)系統(tǒng)中生物的空間分布，同時(shí)評(píng)估種群的組成和數(shù)量。通過(guò)采集空氣、土壤和水等環(huán)境樣本，eDNA分析在水體環(huán)境研究中尤為重要。它不僅能以非侵入性的方式檢測(cè)稀有物種，還可對(duì)多個(gè)營(yíng)養(yǎng)級(jí)的生物進(jìn)行分類和群組分析。與傳統(tǒng)的捕捉和物理鑒定方法相比，eDNA分析速度更快、成本更低，同時(shí)具有更高的敏感性和準(zhǔn)確性。

但是，這項(xiàng)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。環(huán)境中的DNA容易受到降解、污染及操作不當(dāng)?shù)挠绊?，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。尤其在水體環(huán)境中，溫度、pH值、鹽度等物理化學(xué)因素以及微生物活動(dòng)的影響，使得eDNA的保存和分析變得尤為復(fù)雜。因此，如何有效保存eDNA、并優(yōu)化其分析過(guò)程，成為這一領(lǐng)域的關(guān)鍵研究方向。

eDNA的降解問(wèn)題是影響分析準(zhǔn)確性的主要障礙之一。在水體環(huán)境中，DNA降解主要由細(xì)菌活性及光照、溫度等外部條件所驅(qū)動(dòng)。例如，在30°C條件下，歐洲鰻鱺（學(xué)名：Anguilla anguilla）eDNA的降解速度顯著快于低溫環(huán)境。同樣，在高溫條件下，歐洲林蛙（學(xué)名：Rana temporaria）eDNA在短短幾天內(nèi)便會(huì)降解超過(guò)80%。為應(yīng)對(duì)這一問(wèn)題，采集的樣本通常需快速冷凍保存，儲(chǔ)存溫度要求在?20°C至?40°C之間。然而，這一高標(biāo)準(zhǔn)對(duì)偏遠(yuǎn)地區(qū)的采樣工作提出了嚴(yán)格的技術(shù)和設(shè)備要求。即便使用現(xiàn)場(chǎng)過(guò)濾法減少降解風(fēng)險(xiǎn)，也會(huì)因水體渾濁度增加過(guò)濾時(shí)間，同時(shí)增加交叉污染的可能性。

研究人員目前正在探索多種化學(xué)儲(chǔ)存液（如乙醇或裂解緩沖液）在eDNA保存中的作用。但這些方法在實(shí)際應(yīng)用中存在局限性，例如乙醇保存樣本的eDNA回收率較低，限制了其效果。因此，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)且高效的eDNA保存方法，顯得尤為重要。

為解決這一難題，研究人員提出了通過(guò)陽(yáng)離子表面活性劑（如苯扎氯銨）處理水樣，以延緩eDNA降解并提高回收率的策略。實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)這種化合物處理的樣本，數(shù)小時(shí)后仍能保留大部分eDNA。這種方法在無(wú)需嚴(yán)格冷凍條件的情況下，能夠顯著改善偏遠(yuǎn)地區(qū)的eDNA監(jiān)測(cè)工作。然而，陽(yáng)離子表面活性劑雖然對(duì)DNA保存有效，卻可能與DNA發(fā)生物理或化學(xué)相互作用，從而影響后續(xù)的定量分析。為此，研究人員優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)流程，通過(guò)樣本預(yù)處理和離心步驟解決了這一問(wèn)題。此外，他們進(jìn)一步測(cè)試了這種化合物對(duì)水體中代表性微生物和細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)其不僅能有效延緩DNA降解，還具備一定的抗菌作用。

在具體分析過(guò)程中，研究人員結(jié)合定量PCR（qPCR）和數(shù)字PCR（ddPCR）技術(shù)，對(duì)樣本中的eDNA進(jìn)行了精準(zhǔn)的定量測(cè)定。與傳統(tǒng)方法相比，ddPCR在低濃度和低質(zhì)量樣本的檢測(cè)中表現(xiàn)出更高的靈敏度，尤其在成分復(fù)雜的環(huán)境樣本中，能提供更準(zhǔn)確的定量結(jié)果。這種技術(shù)改進(jìn)大幅提高了eDNA分析的可靠性，使其在水體生物多樣性監(jiān)測(cè)中具有更廣泛的應(yīng)用潛力。

材料與方法
實(shí)驗(yàn)所需的主要化學(xué)試劑包括購(gòu)自Sigma Aldrich公司的BAC、CPC和CTAB，純度為98%~99%。用于DNA提取的試劑盒DNeasy PowerWater Kit來(lái)自Qiagen公司，其他試劑則由Merck、Thermo Fisher Scientific和Bio-Rad公司提供。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，研究者設(shè)置了三個(gè)30升的中型模擬生態(tài)水箱，每箱按照5條斑馬魚(yú)每升的密度養(yǎng)殖斑馬魚(yú)，飼養(yǎng)5天后進(jìn)行水樣采集。實(shí)驗(yàn)前，水箱以10%的漂白液浸泡15分鐘，隨后使用去離子水反復(fù)沖洗。斑馬魚(yú)飼養(yǎng)期間，水溫保持在22°C±2°C，光照與黑暗周期為14小時(shí)和10小時(shí)。采樣前，斑馬魚(yú)通過(guò)干凈的細(xì)孔網(wǎng)撈出。隨后，將每箱的水樣轉(zhuǎn)移至10升塑料容器中，并分別加入0.01%的BAC、CPC或CTAB，通過(guò)充分搖勻確?；旌暇鶆颍S后在室溫下存放進(jìn)行后續(xù)分析。時(shí)間點(diǎn)為0小時(shí)的水樣在加入表面活性劑后立即過(guò)濾，未添加任何表面活性劑的水樣作為空白對(duì)照組。

eDNA的提取在采樣后30分鐘內(nèi)完成。每次取500毫升水樣通過(guò)0.45微米孔徑的硝酸纖維素濾膜過(guò)濾，濾膜隨后使用Qiagen試劑盒中的PowerWater DNA Bead Tube進(jìn)行DNA提取。DNA濃度通過(guò)DeNovix DS-11分光光度計(jì)測(cè)定。

研究還采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）和數(shù)字PCR（ddPCR）技術(shù)檢測(cè)斑馬魚(yú)線粒體DNA的變化。為實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)，設(shè)計(jì)了一對(duì)針對(duì)線粒體細(xì)胞色素b（cyt b）區(qū)域的引物，并通過(guò)PrimerBlast軟件驗(yàn)證其特異性。qPCR反應(yīng)條件包括95°C預(yù)變性2分鐘，接著40個(gè)循環(huán)的95°C變性5秒和60°C退火30秒。ddPCR實(shí)驗(yàn)中，將樣本分為液滴后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終通過(guò)熒光檢測(cè)器分析DNA拷貝數(shù)。

為了量化DNA降解速率，研究使用一級(jí)對(duì)數(shù)線性模型擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算降解速率常數(shù)（k）和半衰期（T1/2）。此外，通過(guò)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)估表面活性劑對(duì)微生物的抑制作用，目標(biāo)包括綠藻、常見(jiàn)的細(xì)菌如大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，以及酵母菌等。細(xì)胞活性通過(guò)MTT比色法測(cè)定，計(jì)算抑制濃度IC50。實(shí)驗(yàn)表明，這些表面活性劑對(duì)微生物和真核細(xì)胞均存在不同程度的毒性。

此外，研究還通過(guò)EtBr排除實(shí)驗(yàn)探討了陽(yáng)離子表面活性劑與DNA之間的相互作用。結(jié)果表明，不同表面活性劑均能影響EtBr與DNA的結(jié)合，進(jìn)一步揭示了表面活性劑可能通過(guò)破壞DNA穩(wěn)定性導(dǎo)致其降解。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，重點(diǎn)對(duì)不同處理組間的DNA濃度變化趨勢(shì)進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，表面活性劑對(duì)斑馬魚(yú)mtDNA的降解速率具有顯著影響，且BAC、CPC和CTAB在不同濃度和作用時(shí)間下對(duì)環(huán)境和生物的毒性特性各不相同。

結(jié)果與討論
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在未經(jīng)處理的水中，mtDNA在30天內(nèi)僅保留0.1%至1.8%。而在添加表面活性劑后，保存效果顯著提高：經(jīng)CTAB處理的水樣qPCR檢測(cè)顯示30天后mtDNA的保留率高達(dá)26.3%，ddPCR則顯示為51.8%。相比之下，CPC和BAC處理后的保留率分別為17.6%和2.2%（qPCR）及55.9%和13.5%（ddPCR）。這一差異表明，CTAB在eDNA保存方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，同時(shí)ddPCR的檢測(cè)靈敏度和數(shù)據(jù)一致性優(yōu)于qPCR，尤其在目標(biāo)DNA濃度較低或質(zhì)量較差的樣本中。

通過(guò)線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，CTAB處理組的mtDNA降解速率最慢，呈現(xiàn)出顯著的時(shí)間穩(wěn)定性。在進(jìn)一步的混合效應(yīng)模型分析中，CTAB在短期和長(zhǎng)期保存中的表現(xiàn)均優(yōu)于其他處理組，這可能歸因于其強(qiáng)大的DNA結(jié)合能力及抑菌特性。此外，CPC在短期保存中也表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，而B(niǎo)AC處理組則因其不穩(wěn)定的保留率和較高的降解速率表現(xiàn)相對(duì)較差。研究還表明，與傳統(tǒng)的現(xiàn)場(chǎng)水過(guò)濾方法相比，CTAB基的保存方法更為便捷高效，減少了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，并顯著提高了DNA的保存效果。

在對(duì)eDNA的降解速率分析中，通過(guò)假設(shè)一階降解模型計(jì)算得出，不同處理組的降解速率常數(shù)和半衰期存在顯著差異。CTAB處理組的日降解速率最低（qPCR為0.03，ddPCR為0.04），相應(yīng)的eDNA半衰期最長(zhǎng)（分別為21天和16.6天）。相比之下，未經(jīng)處理的水樣降解速率最高，半衰期最短（qPCR為4.2天，ddPCR為7天）。這些結(jié)果表明，CTAB和CPC能夠顯著延長(zhǎng)eDNA的半衰期，從而為長(zhǎng)期生態(tài)監(jiān)測(cè)和環(huán)境評(píng)估提供了有效的解決方案。

陽(yáng)離子表面活性劑的抗菌性能在eDNA保存中同樣起到了關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)表明，0.01%的BAC、CPC和CTAB均能顯著抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，處理后的水樣中未檢測(cè)到細(xì)菌增殖。這種強(qiáng)效的抗菌活性歸因于陽(yáng)離子表面活性劑分子與細(xì)菌細(xì)胞膜的相互作用，破壞了細(xì)胞膜的完整性，從而降低了微生物對(duì)eDNA的降解作用。此外，熒光光譜實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了CTAB和CPC能夠通過(guò)與DNA的靜電作用和疏水相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而保護(hù)DNA免受降解酶的破壞。

不過(guò)，該研究也指出，盡管陽(yáng)離子表面活性劑在eDNA保存中表現(xiàn)出諸多優(yōu)點(diǎn)，但其潛在的細(xì)胞毒性不容忽視。實(shí)驗(yàn)表明，BAC對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50值最低，表明其毒性最高，而CPC和CTAB的毒性相對(duì)較低。這些結(jié)果提示，在實(shí)際應(yīng)用中需合理選擇表面活性劑的種類和濃度，以平衡其保存效果與生物安全性。

本研究系統(tǒng)評(píng)估了BAC、CPC和CTAB在eDNA保存中的效果，并證明了CTAB在延長(zhǎng)eDNA保留時(shí)間、降低降解速率和提高抗菌活性方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。這為基于eDNA的生態(tài)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)和生物多樣性評(píng)估提供了一種高效、便捷且穩(wěn)定的保存策略。未來(lái)的研究可進(jìn)一步優(yōu)化表面活性劑的使用條件，并探索其在不同環(huán)境條件下的適應(yīng)性和應(yīng)用潛力，從而為全球生物多樣性保護(hù)提供更堅(jiān)實(shí)的技術(shù)支持。

信息源 | Thamke, Viresh, et al.
編譯 | 王芊佳

編輯 | 綠茵
排版 | 綠葉

參考資料略