肺癌是最常見(jiàn)的癌癥之一，也是世界上存活率最低的癌癥之一。細(xì)胞因子是一種小型蛋白信號(hào)，已被證明可有效增強(qiáng)抗腫瘤效果。其中，白細(xì)胞介素-12（IL-12），作為細(xì)胞介導(dǎo)免疫的有效誘導(dǎo)劑，具有刺激活化 T 細(xì)胞和 NKT 細(xì)胞的效應(yīng)功能，在肺癌等實(shí)體瘤中顯示出良好的抗腫瘤作用。但由于它的脫靶毒性和給藥方式的低效性，其應(yīng)用受到限制。

IL-12 的應(yīng)用到多方面因素的限制

1. 遞送的 mRNA 表達(dá)短暫，需要頻繁給藥
目前 IL-12 的遞送方法，主要是將 IL-12 mRNA 封裝在脂質(zhì)納米顆粒（LNPs），然后向腫瘤遞送。但傳統(tǒng) mRNA 遞送后表達(dá)短暫，因此不得不提高給藥頻率。改為遞送自復(fù)制 mRNA 可以彌補(bǔ)傳統(tǒng) mRNA 表達(dá)短暫的不足并降低給藥頻率，但也面臨幾個(gè)挑戰(zhàn)，包括由于其分子量大導(dǎo)致表達(dá)不穩(wěn)定，體內(nèi)遞送效率低，以及由于與堿基修飾的兼容性差而導(dǎo)致相對(duì)較高的免疫原性。

2. 腫瘤組織的低 pH 值和缺氧等特性或影響遞送的 mRNA 表達(dá)水平
可能由于腫瘤組織的低 pH 值和缺氧等特性，LNPs 在腫瘤組織中遞送的 mRNA 表達(dá)水平較低。此外，不同癌癥類型的腫瘤細(xì)胞特性各異，因此可能需要針對(duì)不同癌癥類型定制 LNPs，以優(yōu)化腫瘤組織中的 RNA 轉(zhuǎn)染效率，從而提高抗腫瘤療效。

3. IL-12 全身給藥可導(dǎo)致脫靶毒性
目前，給藥 IL-12 的最佳方式似乎包括連續(xù) 5 天靜脈輸注或 2 周皮下注射。但頻繁全身給藥和皮下給藥 IL-12，已被證實(shí)可產(chǎn)生劑量依賴性不良事件。
近日，針對(duì)以上問(wèn)題，多倫多大學(xué)李博文團(tuán)隊(duì)提出了新的解決辦法，并發(fā)表在Advanced Materials雜志上。他們篩選出針對(duì)肺癌的 H1L1A1B3 可電離脂質(zhì)，將其整合進(jìn)脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）。然后利用這些納米顆粒包封核酸，但包封的是 IL-12 circRNA，而不是 IL-12 mRNA。接著將給藥方式由以往的多次靜脈注射全身給藥，改為單次瘤內(nèi)注射和氣管內(nèi)給藥，將 IL-12 circRNA 有效遞送到肺部腫瘤，并聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療（ICI），最終提高了肺癌免疫治療的效果。

這項(xiàng)研究不僅為肺癌開(kāi)創(chuàng)了一種新的基于 circRNA 的免疫療法，而且還引入了一種針對(duì)特定癌癥類型定制 LNP 的個(gè)性化方案。

這種創(chuàng)新的、定制化的免疫療法，效果如何？
1. 定制 H1L1A1B3 LNPs 可將 RNA 轉(zhuǎn)染效率提高 4 倍，并主動(dòng)激活先天免疫通路
研究人員采用組合化學(xué)來(lái)篩選可電離脂質(zhì)，并將 H1L1A1B3 篩選為 Lewis 肺癌細(xì)胞中有效遞送 IL-12 circRNA 的可電離脂質(zhì)候選物。當(dāng) H1L1A1B3 被整合進(jìn)脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）后，H1L1A1B3 LNPs 在 LLC1 肺癌細(xì)胞系中展現(xiàn)了 circRNA 轉(zhuǎn)染效率的顯著提升。這一效率是輝瑞/拜恩泰科公司 COVID-19 mRNA 疫苗中所使用的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) LNP ALC-0315 的四倍。
研究還發(fā)現(xiàn)，空載的 H1L1A1B3 LNPs 能顯著誘導(dǎo) NF-κB 活化并觸發(fā) IRF 通路，先天免疫系統(tǒng)可通過(guò)這兩種途徑誘導(dǎo)I型干擾素（IFN）和細(xì)胞因子（TNF-α）的產(chǎn)生。這些結(jié)果表明，H1L1A1B31 是一種雙功能脂質(zhì)，能夠促進(jìn)有效的 circRNA 遞送，并主動(dòng)刺激先天免疫通路激活。

2. 包裹在 H1L1A1B3 LNPs 中的 IL-12 circRNA 降解延遲，在體外和體內(nèi)產(chǎn)生更持久的RNA表達(dá)
通過(guò)連續(xù) 7 天收集 IL-12 circRNA 和 IL-12 mRNA 處理的肺癌細(xì)胞系的上清液發(fā)現(xiàn)，與 IL-12 mRNA 的表達(dá)相比，IL-12 circRNA 表現(xiàn)出明顯的降解延遲。以肌肉注射的方式給藥小鼠，觀察到的結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致

IL-12 circRNA 和 H1L1A1B3 LNPs 的制備和表征。k) IL-12 circRNA LNP 在腫瘤細(xì)胞中的傳遞和翻譯過(guò)程。l)在兩種小鼠腫瘤模型中應(yīng)用兩種不同的給藥途徑。m) IL-12 circRNA 重塑腫瘤微環(huán)境和腫瘤免疫治療的機(jī)制。

這些結(jié)果表明，在相同情況下，circRNA 在體內(nèi)的表達(dá)窗口大于 mRNA 的表達(dá)窗口，這有助于誘導(dǎo)持續(xù)的體液免疫反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)表明，包裹在 H1L1A1B3 LNPs 中的 IL-12 circRNA 能夠在體外和體內(nèi)產(chǎn)生持續(xù)的 circRNA 表達(dá)。

3. 通過(guò)瘤內(nèi)注射 IL-12 circRNA LNPs 改進(jìn) Lewis 肺癌免疫療法
基于以上研究結(jié)果，研究人員試圖評(píng)估含有定制脂質(zhì)配方和 IL-12 circRNA 有效載荷的非病毒基因遞送系統(tǒng)在肺癌模型中的治療潛力。為了減輕與全身給藥相關(guān)的脫靶毒性，研究人員探索了腫瘤內(nèi)給藥對(duì)腫瘤免疫治療有效性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單次瘤內(nèi)給藥 IL-12 circRNA LNPs 也足以延緩腫瘤進(jìn)展，與 ICI（抗PD- 1）聯(lián)合治療則顯示出誘導(dǎo)腫瘤強(qiáng)勁消退的能力。
具體而言，與治療組相比，未治療組的腫瘤組織增殖迅速，對(duì)體重的影響顯著。而與 ICI 單藥治療組相比，IL-12 circRNA LNPs 聯(lián)合 ICI 治療組的小鼠沒(méi)有因腫瘤生長(zhǎng)而出現(xiàn)明顯的體重減輕或體重增加。因此，研究人員推測(cè)，在未治療組和治療組之間觀察到的巨大體重差異受到兩組之間腫瘤進(jìn)展率差異的影響。

腫瘤接種后小鼠體重隨時(shí)間的變化

4. IL-12 circRNA LNPs 的氣管內(nèi)給藥抑制 NSCLC 進(jìn)展
為了探索可行的腫瘤免疫治療的替代給藥途徑，研究人員在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）臨床前模型中采用氣管內(nèi)給藥。通過(guò) BLI 監(jiān)測(cè)治療前后的腫瘤生長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)治療的小鼠肺腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)，而 IL-12 circRNA 處理的小鼠肺腫瘤負(fù)荷顯著降低。
具體而言，研究人員通過(guò)尾靜脈將熒光素酶標(biāo)記的肺癌細(xì)胞株注射到小鼠體內(nèi)，利用小動(dòng)物活體光學(xué)成像（IVIS）在固定時(shí)間點(diǎn)觀察和統(tǒng)計(jì)肺部腫瘤的生長(zhǎng)。IVIS 結(jié)果顯示 IL-12 circRNA 處理組的熒光量隨治療時(shí)間推移逐漸降低，經(jīng)醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與為治療組相比，IL-12 circRNA 處理組治療后的腫瘤負(fù)荷顯著降低。結(jié)果如下圖所示。

b 圖為未治療組和 IL-12 circRNA LNP 處理組小鼠的IVIS圖像，c 圖為未治療組和 IL-12 circRNA LNP 處理組小鼠中熒光素酶信號(hào)的量化
研究人員還通過(guò)肺 H&E 染色量化切片中腫瘤組織面積的百分比，進(jìn)而在組織學(xué)上量化腫瘤負(fù)荷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未治療組相比，IL-12 circRNA 處理組治療后的腫瘤面積顯著降低。結(jié)果如下圖所示。

小鼠安樂(lè)死后肺部組織的H&E染色圖和腫瘤組織面積差異的量化圖
研究結(jié)果還表明，IL-12 circRNA 介導(dǎo)的腫瘤免疫治療在肺癌模型中產(chǎn)生了顯著水平的細(xì)胞因子（主要是 IFN-γ ），從而證實(shí)了 IL-12 在臨床前模型中作為抗腫瘤免疫誘導(dǎo)劑的有效性。此外，T 細(xì)胞和 NKT 細(xì)胞釋放的 IFN-γ 介導(dǎo)了腫瘤微環(huán)境（TME）內(nèi)有利的免疫表型，這對(duì)抗腫瘤療效至關(guān)重要。這些結(jié)果表明，IL-12 circRNA LNP 通過(guò)氣管可有效控制肺癌的生長(zhǎng)。

結(jié)語(yǔ)
IL-12 通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤免疫原性，而有策略地應(yīng)用免疫刺激脂質(zhì)納米顆粒和聯(lián)合使用免疫檢查點(diǎn)抑制劑等，可進(jìn)一步提高 IL-12 的抗腫瘤效果。
多倫多大學(xué)李博文團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種新的 LNP 遞送策略，可以有效地將細(xì)胞因子編碼 circRNA 遞送到腫瘤。這種新的遞送策略通過(guò)直接對(duì)癌癥部位給藥進(jìn)行免疫治療，為目前的肺癌免疫治療帶來(lái)了新希望?？偟膩?lái)說(shuō)，該研究結(jié)果表明，作為肺癌患者潛在的新的免疫療法，這種遞送系統(tǒng)值得進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

參考文獻(xiàn)：
[1]S. Xu,Y. Xu,N. C. Solek,J. Chen,F. Gong,A. J. Varley,A. Golubovic,A. Pan,S. Dong,G. Zheng,B. Li,Tumor-Tailored Ionizable Lipid Nanoparticles Facilitate IL-12 Circular RNA Delivery for Enhanced Lung Cancer Immunotherapy.Adv. Mater.2024, 2400307.https://doi.org/10.1002/adma.202400307IF: 29.4 Q1